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實時熒光定量PCR試劑盒常見技術原理
點擊次數：25 更新時間：2026-01-16
實時熒光定量PCR試劑盒是分子生物學領域核酸定量檢測的核心工具，廣泛應用于臨床診斷、病原檢測、基因表達分析等場景。其核心原理是在PCR擴增過程中，通過熒光信號的實時采集與分析，實現對靶核酸的精準定量，避免傳統PCR需電泳檢測的繁瑣步驟。目前主流試劑盒基于四種核心技術原理設計，分別為TaqMan探針法、SYBR Green染料法、分子信標法與LNA增強法，各類原理在特異性、靈敏度、適用場景上各有側重，適配不同檢測需求。
TaqMan探針法：特異性靶向定量，適配精準檢測場景。該原理依賴特異性探針與引物的雙重靶向作用，試劑盒包含一對特異性引物與一條兩端標記熒光基團（報告基團）和淬滅基團的TaqMan探針。擴增初期，探針完整結合于靶序列，淬滅基團通過熒光共振能量轉移（FRET）抑制報告基團發光；當PCR擴增進行時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針降解，報告基團與淬滅基團分離，熒光信號釋放。每擴增一個循環，就釋放一個熒光分子，熒光強度與擴增產物量呈正比，通過標準曲線即可實現靶核酸的定量分析。其特異性較強，可有效區分同源序列，適用于病原分型、基因突變檢測等對特異性要求高的場景。
SYBR Green染料法：通用型熒光定量，適配低成本檢測。作為常用的通用型技術原理，SYBR Green試劑盒以熒光染料為核心檢測元件，無需設計特異性探針。SYBR Green I是一種雙鏈DNA（dsDNA）特異性結合染料，游離狀態下熒光信號微弱，與dsDNA結合后熒光強度可增強數千倍。PCR擴增過程中，染料隨dsDNA產物的累積持續結合，熒光信號同步增強，通過監測熒光閾值循環數（Ct值）反映靶核酸初始濃度。該原理操作簡便、成本較低，可適配任意靶序列檢測，但無法區分特異性擴增產物與非特異性條帶（如引物二聚體），需通過熔解曲線分析驗證結果可靠性，適用于基因表達分析、常規病原篩查等場景。
分子信標法：構象變化觸發熒光，強化特異性識別。分子信標試劑盒的核心是具有莖環結構的特異性探針，探針環部序列與靶核酸互補，莖部由互補堿基配對形成，兩端分別標記報告基團與淬滅基團。無靶核酸時，探針呈莖環構象，淬滅基團與報告基團靠近，熒光被抑制；當靶核酸存在時，探針環部與靶序列特異性結合，莖環結構解開，報告基團與淬滅基團分離，釋放熒光信號。其特異性優于SYBR Green染料法，且熒光信號背景低，靈敏度較高，可用于低豐度靶核酸檢測及實時原位定量，但探針設計難度大、成本較高，限制了其大規模普及應用。
LNA增強法：核酸結合增強技術，提升檢測靈敏度。鎖核酸（LNA）增強法是在傳統探針或引物設計中引入LNA修飾堿基，LNA是一種人工合成核酸類似物，與天然核酸結合時親和力更強、穩定性更高。試劑盒通過在引物或探針中插入LNA堿基，可顯著提升探針與靶核酸的結合效率，降低非特異性結合，同時增強擴增反應的特異性與靈敏度，尤其適用于高GC含量、短片段靶核酸或低豐度靶序列檢測。該原理可有效解決傳統試劑盒對復雜靶序列擴增效率低、信號弱的問題，在臨床低濃度病原檢測、稀有基因突變分析中具有顯著優勢。
實時熒光定量PCR試劑盒的各類技術原理均基于“熒光信號與擴增產物同步累積”的核心邏輯，通過不同熒光觸發機制實現定量檢測。TaqMan探針法與分子信標法以特異性取勝，SYBR Green染料法以通用性和低成本為優勢，LNA增強法則聚焦靈敏度提升。實際應用中需根據檢測目標、特異性需求、成本預算選擇適配原理的試劑盒，隨著核酸檢測技術的迭代，各類原理也在不斷優化，推動qPCR檢測向更精準、更快速、更便捷的方向發展。
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